關(guān)于ELISA樣本的收集！

一般來說，由于ELISA實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)的含量，因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性， -20℃或-80℃保存的樣本應(yīng)在1-6個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)，4℃保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測(cè)。此外，樣本中不能含有會(huì)抑制HRP活性的NaN3，否則會(huì)造成假陰性結(jié)果。

可用于ELISA實(shí)驗(yàn)的樣本一般有血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法也不同。適當(dāng)?shù)臉颖绢A(yù)處理是確保ELISA實(shí)驗(yàn)正確性和準(zhǔn)確性的第一步。這里，我們將介紹幾種不同樣本類型的處理方法。

一、液體樣本

液體樣本處理原則：所有的液體樣本，用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）

1、血清：血清是ELISA實(shí)驗(yàn)常用的樣本，其預(yù)處也十分簡(jiǎn)單。使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本，，將試管或離心管在室內(nèi)溫度下放置自然凝固（視室溫環(huán)境10分鐘到2小時(shí)不等）或4℃過夜，分離出血清，（建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面，使血清能更大程度的分離出來，），2-6℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，立即進(jìn)行測(cè)定，建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

注意事項(xiàng)：在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血，因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，這種情況下，ELISA實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外，樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

2、血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉、枸櫞酸納或檸檬酸鈉作為抗凝劑，使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本，采集后30分鐘內(nèi)，混合10-20分鐘后，2-6℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清液（血漿），建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存，避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

注意事項(xiàng)：檢測(cè)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說明書，查看該試劑盒針對(duì)抗凝劑是否有特殊要求。

3、尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

4、細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液備用，樣本保存在-20℃或-80℃，避免反復(fù)凍融，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5、腦脊液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。(（采集大鼠腦脊液）的方法：采集腦脊液時(shí)，用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口(1. 5cm左右)，在其中點(diǎn)向尾側(cè)沿皮下剪開2cm，將皮分離兩側(cè)，擴(kuò)大視野。緊貼大鼠頭骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側(cè)擴(kuò)大視野。注意，有出血時(shí)用干紗布按壓止血，保持術(shù)口清晰。接近頸后黃韌帶時(shí)，小心地用7號(hào)注射針頭分離附蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用1ml注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成150度鈍角)，針斜面向上，針近水平刺入蛛網(wǎng)膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液，一般采集量為100-200微升。)

6、唾液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

二、固體樣本

固體樣本處理原則：稱取1g的固體樣本，用9g的合適緩沖液溶解，分泌蛋白可以直接離心取上清檢測(cè)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白，要先收集細(xì)胞，再用合適方法破碎，離心取上清測(cè)試。

1、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對(duì)于植物組織，不好勻漿的話，就在液氮中充分研磨。

2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本

許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。

（1）培養(yǎng)的細(xì)胞

A、動(dòng)物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融（如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

B、植物細(xì)胞：用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

（2）組織的細(xì)胞

切割標(biāo)本后，稱取1g組織，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。

細(xì)胞反復(fù)凍融方法

1） 吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，然后加入適量的培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的細(xì)胞沖洗干凈。懸浮細(xì)胞可以省略該步驟。

2） 將細(xì)胞懸浮液收集到離心管中，以1000×g離心10分鐘，然后吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。

3） 加入適量的預(yù)冷PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細(xì)胞。在6孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔需要150-250μL的PBS來重懸細(xì)胞。

4） 使樣本在-20℃或-80℃條件和室溫條件下反復(fù)凍融，重復(fù)凍融過程數(shù)次，直至細(xì)胞裂解。也可以使用超聲波細(xì)胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細(xì)胞。

5） 4℃下以10,000×g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

3、土壤：稱取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工將標(biāo)本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白，直接取上清檢測(cè)，測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

三、植物

1、標(biāo)本的精采集及保存

取0.1g（誤差±3%以內(nèi)）新鮮植物組織樣本，在液氮中充分研磨；加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20℃過夜；于4℃，8000rpm，離心1小時(shí)，取上清；上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙mi（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮?dú)獯蹈桑４鎮(zhèn)溆?；上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液（1ml定容）?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，然后4℃離心（8000rpm，15分鐘），取上清并暫時(shí)保存于4℃待用。

2、植物標(biāo)本中相關(guān)酶或蛋白的測(cè)定：（粗提取）

新鮮植物組織請(qǐng)?jiān)谝旱谐浞盅心?；加入樣品體積9倍的提取液（pH 7.4 PBS緩沖液）,請(qǐng)于4℃，8000rpm，離心30分鐘，取上清并暫時(shí)保存于4℃待用。